①：抗體包被  在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽(yáng)性信號(hào)，干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

②：免疫識(shí)別  在96孔板上包被抗體后，加入待測(cè)樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時(shí)間，通常是1-2小時(shí)。此時(shí)酶標(biāo)板上的抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測(cè)樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等成分的影響。

③：洗板  將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對(duì)應(yīng)的識(shí)別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。

④：酶標(biāo)信號(hào)輸出  加入帶有辣根過(guò)氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。

以抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測(cè)抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原，使之與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測(cè)抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少，輸出的信號(hào)就越少。這樣待測(cè)樣濃度與酶顯色信號(hào)就呈逆相關(guān)。